R&D : Phénotypage Histologique Immunomarquage

🔬 Une technologie unique pour l’étude des tissus

Contrairement à d’autres technologies telles que le séquençage de nouvelle génération ou la cytométrie en flux, l’immunohistochimie (IHC) multiplex en fluorescence est capable de détecter simultanément plusieurs biomarqueurs (détection de > 2-6 cibles (5 + ADN)) sur une seule coupe de tissu avec la conservation de l’architecture tissulaire et des interactions cellulaires.

Cette technologie fournit des informations spatiales sur l’expression de protéines ou sur les interactions cellulaires dans les tissus, ce qui est crucial pour déterminer l’avancement d’une maladie ou caractériser par exemple le microenvironnement tumoral.

🧭 Avantages et innovations du multiplexage fluorescent

Cette technologie est d’autant plus essentielle que certains sous-types cellulaires nécessitent la combinaison de 2 ou 3 marqueurs pour les identifier formellement. Grâce à des systèmes innovants comme la détection fluorescente à base de tyramide, le multiplexage fluorescent séquentiel peut être appliqué avec des anticorps de la même espèce ou nécessitant différentes conditions de démasquage (cf figure).

Cette approche ouvre de nouvelles perspectives pour exploiter au mieux des tissus précieux et lève certaines contraintes du multiplexage traditionnel limité à 3 marqueurs. Elle reste toutefois moins exhaustive que des technologies récentes comme l’imagerie de masse ou la technologie CODEX, mais elle est aussi plus accessible en termes de coût.

🧩 Objectifs scientifiques pour le RHEM

L’objectif pour le RHEM est de proposer aux chercheurs de nouveaux panels d’anticorps validés afin de caractériser les populations et les interactions cellulaires, d’étudier divers processus biologiques (prolifération, mort cellulaire, rupture de l’ADN, etc.) et d’explorer les voies de signalisation cellulaire.

Hybridation In Situ par la Technologie RNAscope

RNAscope

Avantages de cette technologie :

• Haute spécificité et sensibilité, grâce à un design des sondes en double “Z” qui limite les signaux non-spécifiques et autorise une amplification importante du signal
• Ciblage de régions courtes (40- 50 bases), permettant de détecter des ARN partiellement dégradés
• Possibilité de multiplexage, jusqu’à 3 cibles simultanées en plus du marquage nucléaire DAPI
• Compatibilité avec différents types de préparation de tissulaire : microtomie, cryotomie, vibratomie

Approches spécifiques disponibles sur le plateau :

• RNAscope® Multiplex Fluorescent V2 avec ou sans protéase
• miRNAscope
• RNAscopePlus smRNA_RNA
• RNAscope duplex

Transparisation

Plusieurs techniques de transparisation (clearing) chimique sont apparues récemment qui permettent de rendre optiquement transparents les tissus animaux ou humains. Ces techniques s’appliquent à l’analyse d’organes entiers ou de tissus épais en homogénéisant les indices de réfraction à l’intérieur des tissus. Les organes et tissus transparisés peuvent ainsi être observés en 3D jusqu’à 8mm de profondeur en haute résolution, sans passer par les étapes longues et fastidieuses de réalisation de coupes sériées. Les techniques de transparisation présentent donc un grand intérêt dans l’analyse des processus biologiques dans des organes normaux ou pathologiques, aussi bien en biologie fondamentale qu’en sciences médicales.

La technologie

Avec le soutien de la région Occitanie, de l’Europe (FEDER) et de l’université de Montpellier, le  RHEM s’est équipé d’un système de transparisation X-Clarity (Logos BioSystems) qui permet d’accélérer très efficacement et de façon reproductible la délipidisation des tissus sans utilisation de solvants ou de réactifs hautement toxiques. Par exemple, cet automate permet de transpariser un cerveau en 5 heures au lieu de 5 à 7 jours manuellement.

L’ « Active Clarity Technique » (ACT) de l’automate permet la conservation des tags fluorescents de modifications géniques (ex. YGF, GFP, Tomato, etc.), est compatible avec les marqueurs fluorescents de transfection (ex. Vybrant+) et les agents intercalants (ex. Dapi, To-Pro-3) et préserve l’antigénicité des tissus (ex. Olig1, GFAP, NF200KD, myosine 7A, etc.). De plus, la transparisation des tissus permet l’utilisation des techniques de génération de deuxième et troisième harmoniques (SHG, THG) pour la visualisation par exemple des fibres de collagène et de l’élastine. Elle permet aussi l’utilisation de l’autofluorescence pour visualiser l’intégralité de la structure des tissus (ex. méninges, fibres musculaires, vaisseaux sanguins, etc.).

D’après Lee et al. (2016)Scientific Reports 6, Article number: 18631 (2016)

Le RHEM propose une prise en charge de projets d’étude 3D avec l’automate X-Clarity, incluant la transparisation, une éventuelle décalcification des tissus, et selon les requêtes des utilisateurs la réalisation des immunofluorescences, l’observation microscopique ainsi que les reconstructions 3D (ex. Imaris) en partenariat avec la plateforme MRI.

Contact

Contactez Chantal Ripoll en charge de cette technologie au sein du RHEM-AdV via notre formulaire de contact RHEM-AdV.

R&D : Biological Tissue Collection

🎯 Objectif du portail BTC

RHEM a développé à l’image d’un biobanque humaine un portail web d’interrogation d’une banque de blocs paraffine issus des modèles animaux de maladies humaines générés par les chercheurs de Montpellier. Ce portail dénommé « Biological Tissue Collection » (BTC) a pour but de participer à la règle des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et à valoriser des ressources biologiques précieuses.

🧩 Contenu et soutiens du projet

Dans un premier temps, seuls les modèles animaux sauvages ou développant spontanément des pathologies ou modifiés génétiquement seront intégrés dans cette BTC. L’intégration des modèles animaux ayant reçu des greffes de cellules humaines/murines ou des tissus humains sera effectuée ultérieurement. Ce projet est soutenu par la Région Occitanie, l’Europe, IBiSA, BioCampus Montpellier et le SiRIC Montpellier Cancer.

💻 Fonctionnement et gestion

Le portail de la BTC s’appuiera sur le logiciel de gestion du plateau d’histologie (100lims4histo-RHEM) développé par la société ASA (Advanced Solutions Accelerator). Ce logiciel enregistre les commandes des chercheurs, celles-ci récapitulant les prélèvements effectués, avec les données associées à l’animal et au prélèvement – espèce, fonds génétique, génotype, âge, sexe, organe, etc. – ainsi que tous les actes techniques effectués : inclusion du prélèvement en bloc de paraffine, obtention de lames colorées ou immunomarquées à partir de ce bloc, numérisation des lames, etc.

ASA ( Advanced Solutions Accelerator)

🌱 Valorisation et impact éthique

Grâce à ce portail, le RHEM donnera l’opportunité aux chercheurs qui le souhaitent de mieux valoriser leurs blocs de paraffine générés en les rendant interrogeables et visibles. Cela permettra d’augmenter le potentiel scientifique des blocs générés par les chercheurs en leur donnant une seconde vie. D’un point de vue éthique, cet outil a pour ambition de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche expérimentale.